Estudo da regulação da expressão do sintase de ácidos gordos de Saccharomyces cerevisiae na aquisição de resistência ao peróxido de hidrogénio

Tese de mestrado, Bioquímica (Bioquímica Médica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2010A exposição das células de Saccharomyces cerevisiae a doses sub‐letais de H2O2 torna-as mais resistentes a doses letais posteriores, ocorrendo alterações na permeabilidade da membrana plasmática. As células adaptadas ao H2O2 apresentam uma menor expressão do gene FAS1 e uma diminuição da actividade do sintase de ácidos gordos. O FAS1 é regulado pelos níveis de inositol, possuindo a sequência UASINO na região promotora, sendo a expressão reprimida quando o inositol aumenta intracelularmente. Na tentativa de compreender os mecanismos moleculares envolvidos na regulação do gene FAS1 pelo H2O2, tomou‐se como premissa que o H2O2 reprime a expressão do gene FAS1 através da indução dos níveis de inositol. Determinaram‐se os níveis de inositol em células wt controlo e tratadas com 150 μM de H2O2 em estado estacionário (10 min e 20 min), observando‐se uma diminuição drástica destes níveis nas células tratadas, contrariando a hipótese inicial. Contudo, expondo células opi1Δ + GFP‐Opi1p ao H2O2 nas mesmas condições, observou‐se a translocação máxima da proteína Opi1p do retículo endoplasmático para o núcleo aos 20 min, de acordo com o mecanismo de regulação pelo inositol. Para apoiar a hipótese, quantificaram‐se os fosfolípidos cuja síntese é regulada pelo inositol e analisou‐se a expressão de alguns genes cujo produto regula essa síntese. Não foram observadas diferenças significativas na composição fosfolipídica total durante a exposição ao H2O2, excepto uma tendência para um aumento de fosfatidiletanolamina aos 5 min e uma diminuição aos 10 min, e um aumento dos níveis de fosfatidilcolina aos 20 min. O H2O2 reprimiu (INM1, INO2, CHO1, URA7 e PIS1) e induziu (GPT2) a expressão de vários genes da síntese de fosfolípidos. A expressão de INO1 foi oscilatória, sendo induzida e reprimida aos 20 e 40 min, respectivamente. A expressão de ITR1 foi reprimida logo aos 10 min. Estes resultados apoiam a existência nas células de levedura de uma resposta coordenada da expressão de genes envolvidos na biossíntese de fosfolípidos e ácidos gordos ao H2O2.The exposure of Saccharomyces cerevisiae cells to sub‐lethal doses of H2O2 makes them more resistant to additional exposure to lethal doses, and induces changes in the plasma membrane permeability. Cells adapted to H2O2 show a decreased expression of the FAS1 gene and a decreased activity of fatty acid synthase. FAS1 is regulated by inositol levels, having a UASINO sequence in its promoter region. FAS1 expression is repressed when intracellular inositol is increased. To understand the molecular mechanisms of FAS1 regulation by H2O2, it was hypothesized that H2O2 represses FAS1 expression through the induction of inositol levels. The levels of inositol in wt cells exposed to steady‐state 150 μM of H2O2 (10 min and 20 min) were determined, and a dramatic decrease in those levels in the treated cells was observed, contradicting the original hypothesis. However, when opi1Δ + GFP‐Opi1p cells were exposed to the same H2O2 conditions, a maximal translocation of Opi1p from the endoplasmic reticulum to the nucleus at 20 min was observed, which is in accordance with a regulatory role for inositol. In order to support the original hypothesis, phospholipids, whose synthesis is regulated by inositol, as well as the levels of expression of some genes whose products regulate that synthesis, were quantified. No significant differences were found in cellular phospholipid composition due to exposure to H2O2, with the exception of a trend for increased phosphatidylethanolamine levels at 5 min and decreased levels at 10 min, and an increased phosphatidylcholine levels at 20 min. H2O2 repressed (INM1, INO2, CHO1, URA7 e PIS1) and induced (GPT2) the expression of several genes involved in phospholipid biosynthesis. The expression of INO1 was oscillatory, being induced and repressed at 20 and 40 min, respectively. ITR1 expression was immediately repressed at 10 min. These results support the existence in yeast cells of a coordinated response in the expression of genes involved in phospholipid and fatty acid biosynthesis to H2O2